與經(jīng)典的液相色譜法相比，高效液相色譜法具有下列主要優(yōu)點：①應用了顆粒極細(一般為10μm以下)、規(guī)則均勻的固定相，傳質(zhì)阻抗小，柱效高，分離效率高;②采用高壓輸液泵輸送流動相，流速快，一般試樣的分析需數(shù)分鐘，復雜試樣分析在數(shù)十分鐘內(nèi)即可完成;③廣泛使用了高靈敏檢測器，大大提高了靈敏度。目前，已經(jīng)發(fā)展了多種不同的固定相，有多種不同的分離模式，使高效液相色譜法的應用范圍不斷擴大。下面介紹高效液相色譜法的有關(guān)知識，新的方法和技術(shù)以及在藥物分析中的應用。

　　一、分類

　　高效液相色譜法按分離機理的不同可分為以下幾類：

　　(一)吸附色譜法(adsorptionchromatography)以吸附劑為固定相的色譜方法稱為吸附色譜法。使用最多的吸附色譜固定相是硅膠，流動相一般使用一種或多種有機溶劑的混合溶劑。在吸附色譜中，不同的組分因和固定相吸附力的不同而被分離。組分的極性越大、固定相的吸附力越強，則保留時間越長。流動相的極性越大，洗脫力越強，則組分的保留時間越短。

　　(二)液-液分配色譜法(liquid-liquidchromatography)液-液分配色譜的固定相和流動相是互不相溶的兩種溶劑，分離時，組分溶入兩相，不同的組分因分配系數(shù)(K)的不同而被分離。目前廣泛使用的化學鍵合固定相是將固定液的官能團鍵合在載體上而制成的，使用化學鍵合固定相的色譜方法(簡稱鍵合相色譜法)可以用分配色譜的原理加以解釋。鍵合相色譜法在HPLC中占有極其重要的地位，是應用最廣的色譜法。按照固定相和流動相極性的不同，分配色譜法又可分為正相色譜法和反相色譜法兩類。

　　1.正相色譜法(normalphasechromatography)固定相極性大于流動相極性的分配色譜法稱為正相分配色譜法，簡稱為正相色譜法。氰基鍵合硅膠、氨基鍵合硅膠等極性的化學鍵合固定相是正相色譜常用的固定相，正相色譜的流動相一般為極性較小的有機溶劑。在正相色譜中，極性小的組分由于K值較小先流出，極性較大的組分后流出。正相色譜法用于溶于有機溶劑的極性及中等極性的分子型物質(zhì)的分離。

　　2.反相色譜法(reversedphasechromatography)流動相極性大于固定相極性的分配色譜法稱為反相分配色譜法，簡稱為反相色譜法。反相色譜法使用非極性固定相，最常用的非極性固定相是十八烷基硅烷鍵合硅膠，還有辛烷基硅烷鍵合硅膠等。流動相常用水與甲醇、乙腈或四氫呋喃的混合溶劑。在反相色譜中極大的組分因K值較小先流出色譜柱，極性較小的組分后流出。流動相中有機溶劑的比例增加，流動相極性減小，洗脫力增強。反相色譜法是目前應用最廣的高效液相色譜法。

　　(三)離子交換色譜法(ionexchangechromatography)離子對交換色譜法是以離子交換劑為固定相的色譜方法，組分因和離子交換劑親和力的不同而被分離。柱填料含有極性可離子化的基團，如羧酸、磺酸或季銨離子，在合適的PH值下，這些基團將解離，吸引相反電荷的物質(zhì)。由于離子型物質(zhì)能與柱填料反應，所以可被分離。

　　樣品中不同的組分因離子交換平衡常數(shù)的不同而分離。離子交換色譜的流動相一般為一定PH值的緩沖溶液，有時也加入少量的有機溶劑，如乙醇、四氫呋喃、乙腈等，以增大組分在流動相中的溶解度。流動相的PH值影響離子交換劑的交換容量。對弱酸或弱堿性的被分離組分，流動相的PH值還會影響其電離狀況，流動相的PH值必須使待分離組分處于離解狀態(tài)，才能被分離。離子交換色譜法用于分離在測定條件下呈離解狀態(tài)的組分，如具有酸性或堿性的化合物，反相離子對色譜法在藥物分析中的應用非常廣泛，例如生物堿、磺胺類藥物、某些抗生素及維生素等的分析均可采用此方法。

　　(四)空間排斥色譜法(stericexclusionchromatography)空間排斥色譜也稱為凝膠色譜。其固定相是具有一定孔徑范圍的多孔性物質(zhì)，即凝膠。被分離組分因分子空間尺寸大小的不同而被分離。當組分被流動相攜帶進入色譜柱時，體積大的分子不能進入固定相表面的孔穴中，而隨流動相直接通過色譜柱，保留時間最短。體積較小的分子可以進入孔穴內(nèi)，在色譜柱中所走的途徑較長，保留時間也較長。分子的尺寸越小，可進入的孔穴越多，所走的路徑越長，保留時間也越長。因此，凝膠色譜中，在一定范圍內(nèi)，體積不同的分子保留時間不同，從而達到分離的目的。凝膠色譜法主要用來分離高分子化合物，如蛋白質(zhì)、多糖等。由于分子量和分子體積有關(guān)，凝膠色譜還可以用來測定組分的分子量。

　　(五)親和色譜法(lighperformanceaffinitychromatography)親和色譜法是利用或模擬生物分子之間的專一性作用，從生物樣品中分離和分析一些特殊物質(zhì)的色譜方法。生物分子之間的專一作用包括抗原與抗體，酶與抑制劑，激素和藥物與細胞受體，維生素與結(jié)合蛋白，基因與核酸之間的特異親和作用等。親和色譜的固定相是將配基連接于適宜的載體上而制成的，利用樣品中各種物質(zhì)與配基親和力的不同而達到分離。當樣品溶液通過色譜柱時，待分離物質(zhì)X與配基L形成X-L復合物，而被結(jié)合在固定相上，其他物質(zhì)由于與配基無親和力而直接流出色譜柱，用適宜的流動相將結(jié)合的待分離物質(zhì)洗脫，如采用一定濃度的醋酸或氨溶液為流動相，減小待分離物質(zhì)與配基的親和力，使復合物離解，從而將被純化的物質(zhì)洗脫下來。

　　HPAC可用于生物活性物質(zhì)的分離、純化和測定，還可以用來研究生物體內(nèi)分子間的相互作用及其機理等。

　　(六)手性色譜法(chiralchromatography)不少有機藥物的結(jié)構(gòu)中有不對稱碳原子，又稱手性碳原子，有手性碳原子的藥物具有旋;光性。立體構(gòu)型不同的一對對映體，其藥效、毒副作用往往不相同。例如抗高血壓藥物а-甲基多巴是S-(-)體;又如氯霉素(含有二個手性碳原子)，只有D-(-)異構(gòu)體有效.而L-()異構(gòu)體完全無效。沙利度胺(反應停)的兩個對映體對小鼠鎮(zhèn)靜作用的效價相近，但只有左旋異構(gòu)體才有胚胎毒及致畸作用。因此，對映體的分離，在藥物的制備和質(zhì)量控制方面，都具有重要的意義。對映體在普通條件下的理化性質(zhì)是相同的，因此分離對映體需要在手性條件下進行。分離對映體的色譜方法稱為手性色譜法。手性色譜法分為間接法和直接法兩種。間接法是將對映體與一定的手性衍生化試劑反應，使其由對映體轉(zhuǎn)變?yōu)榉菍τ丑w，再利用他們理化性質(zhì)的差異，用一般的色譜條件進行分離。直接法不需作衍生化反應，直接利用手性色譜柱或手性流動相進行分離，應用較多，以下主要介紹直接法。

　　1.手性固定相(chiralstationaryPhase，CSP)手性藥物拆分前的對映體通常以鏡象存在，即以外消旋體形式存在。用常規(guī)分析和制備方法不能將其拆分，需引入不對稱(即手性)環(huán)境，使欲拆分的對映體(樣品)、手性作用物(比如固定相)和手性源形成一個非對映異構(gòu)分子的絡(luò)合物。為了形成這樣一種分子絡(luò)合物，分子之間要有一種同時相互存在的作用力，以保持分子的空間定位。Dalgliesh認為至少要有三個作用力，其中一個要有立體選擇性，可以是吸引的，也可以是排斥的。這就是“三點相互作用”理論。如果對映體中某一種對映體正好與此三個作用點配對，相互作用較強，保留時間就長。而另一種對映體因空間構(gòu)型不同，不能完全配對，作用相對較弱，保留時間就短，從而可以得到分離。固定相的作用可以是氫鍵、偶極一偶極作用、π-π作用、靜電作用、疏水作用或空間作用等。

　　l.1常用的手性固定相有以下幾種。

　　(1)Pirkle型手性固定相

　　Pickle型手性固定相是由美國學者Pirkle主持研制的，主要有π-堿性(斥電子基)手性固定相和π-酸性(吸電子基)手性固定相。在分離的過程中，化合物與固定相之間發(fā)生π-π電荷轉(zhuǎn)移相互作用，此類固定相為電荷轉(zhuǎn)移型手性固定相。

　　(2)蛋白質(zhì)類手性因定相

　　蛋白質(zhì)是由手性亞基團氨基酸組成的大分子物質(zhì)，蛋白質(zhì)類手性固定相是將蛋白質(zhì)通過氨基酸鍵合到硅膠上而制成的。常用的蛋白質(zhì)類手性固定相有牛血清蛋白(RSA)和人血a1-酸性糖蛋白(AGP)的手性固定相，商品有ChiralAGP，Resolvosil，EnantioPac等。

　　蛋白質(zhì)類手性固定相應用范圍較廣，效果良好，但該類固定相的譜柱容量較小。常用洗脫系統(tǒng)是磷酸鹽緩沖溶液(PH4～7)，離子強度為0～500mmol，有機改性劑不得超過5%。用蛋白質(zhì)類手性固定相拆分酸性和堿性傾倒物對映體時，流動相內(nèi)可分別加少量離子對試劑，如N，N-二甲基辛胺，叔丁胺氫溴酸鹽和辛酸，以獲得理想的分離結(jié)果。

　　(3)多糖類手性固定相

　　多糖類手性固定相中應用最多的是環(huán)糊精。環(huán)糊精(cyclodextrin,CD)是一類環(huán)形寡聚糖，為手性高分子物質(zhì)，。根據(jù)分子中葡萄糖單元的個數(shù)不同，環(huán)糊精可分為α、β、γ三類，他們分別由6、7、8個D-吡喃葡萄糖組成，將CD分別通過硅烷鏈連接在硅膠表面就構(gòu)成環(huán)糊精手性固定相。環(huán)糊精分子成錐桶狀，內(nèi)腔的直徑由組成環(huán)糊精的葡萄糖個數(shù)決定，如常用的β-環(huán)糊精由7個葡萄糖分子組成，內(nèi)腔直徑為0.8nm。

　　用環(huán)糊精手性固定相進行分離時，首先要求被拆分的組分進人洞穴，形成包合物，保留時間以組分能否進人洞穴及其緊密的程度而定，環(huán)糊精環(huán)上還有多個手性中心，能選擇性地;與對映體作用，從而導致對映異構(gòu)體的保留不同而被分離。如用β-環(huán)糊精手性固定相已經(jīng)成功地分離了二茂鐵等金屬有機絡(luò)合物、氨基酸以及生物堿等。

　　除環(huán)糊精外，多糖類的手性固定相還可以用纖維素、直鏈淀粉作成，如纖維素三醋酸醋手性固定相、纖維素三苯甲酸醋手性固定相和纖維素氨基甲酸酯手性固定相等。

　　(4)冠醚(Grownether)類手性固定相

　　冠醚與環(huán)糊精類似，是本身具有手性的低聚糖，是含醚鍵的環(huán)狀化合物，呈王冠狀結(jié)構(gòu)，外層是親脂性的乙撐基，環(huán)的內(nèi)層是富電子的雜原子，如氧、氮、硫等。通常使用的是18-冠-6的衍生物，健合在聚苯乙煒骨架或硅膠上，形成冠醚手性固定相。用冠醚手性固定相分離對映體時，不同對映異構(gòu)體因與冠醚環(huán)腔形成的主客體絡(luò)合物的穩(wěn)定性不同而被分離。在冠醚上引人雙萘基，雙萘基可以形成“手性墻”，增加固定相的立體選擇性。能質(zhì)子化的氨基化合物，特別是氨基酸對映體在冠醚手性固定相上可以得到很好的分離。

　　除以上手性固定相外，還有模擬酶手性固定相、配位交換手性固定相等。

　　2.手性流動相(chiralmobilephase，CMP)拆分法

　　手性流動相拆分法是將手性試劑添加到流動相中，利用手性試劑與對映異構(gòu)體結(jié)合的穩(wěn)定常數(shù)不同或結(jié)合物在固定相上分配的差異進行分離。近年來，手性流動相拆分法已廣泛應用于藥物對映體的拆分。此法的最大優(yōu)勢在于：可采用普通的非手性固定相，不需對樣品進行衍生化，手性添加物本身可流出，也可更換，同時添加物的可變范圍較寬，穩(wěn)定性好，且價格便宜。

　　(1)配體交換型手性添加劑

　　配體交換型手性添加劑由手性配基和含二價金屬離子的鹽組成。手性配基多為具有光學活性的氨基酸及其衍生物，他們和二價金屬離子螯合，分布于流動相中，遇到待分離的對映異構(gòu)體時，即形成配合物，再在流動相和固定相之間分配而實現(xiàn)分離。分離的機理一般認為是配基和金屬離子形成的螯合物被吸附在固定相上，形成動態(tài)的手性固定相而發(fā)揮作用。也可以看成是手性配基、金屬離子和對映異構(gòu)體形成的配合物穩(wěn)定常數(shù)不同而產(chǎn)生分離。采用5μm粒徑的C18固定相，阿司帕坦作為CMPA，與硫酸銅絡(luò)合，測定高血溶素患者尿中D-和L-2-哌啶酸的濃度。

　　(2)環(huán)糊精添加劑

　　環(huán)糊精在水中有一定的溶解度，用環(huán)糊精作為手性添加劑，加入流動相中，其分離機理與環(huán)糊精手性固定相相同，但保留行為正好相反。對映異構(gòu)體與環(huán)糊精形成的包合物穩(wěn)定性越強，隨流動相出柱越快，保留時間越短。

　　(3)手性離于對添加劑

　　解離的有機化合物能與含互補電荷的試劑相互作用，生成電中性離子對。分離帶電荷的對映異構(gòu)體時，可以在流動相中添加手性的離子對試劑，對映異構(gòu)體和離子對試劑形成電中性的離子對，離子對在固定相和流動相間分配系數(shù)不同而得到分離。常用的手性離子對試劑有(+)10-樟腦磺酸、奎寧等。

　　二、高效液相色譜儀高效液相色譜儀主要由輸液系統(tǒng)、進樣系統(tǒng)、色譜柱系統(tǒng)、檢測系統(tǒng)、數(shù)據(jù)記錄處理系統(tǒng)等組成。

　　(一)輸液泵

　　高效液相色譜的流動相采用高壓泵輸送，有不同類型的輸液泵，按輸液性質(zhì)可分為恒壓泵和恒流泵。目前使用較多的是柱塞式往復泵，柱塞式往復泵為恒流泵，可按設(shè)定的流速輸送流動相，流量不受柱阻力的影響，可保持恒定，并容易清洗和更換。由于柱塞式往復泵是通過柱塞的往復運動來關(guān)液的，所以輸液的脈動性較大。目前多采用雙泵補償?shù)姆椒�減小脈動性。雙泵補償是同時使用兩個泵進行工作，兩個泵可以按串聯(lián)或并聯(lián)方式連拉，交替送液，相互補償，達到減小脈動的目的。

　　(二)進樣器

　　進樣器是將試樣送入色譜柱的裝置。一般要求進樣裝置的密封性好，死體積小，重復性好，保證中心進樣，進樣時對色譜系統(tǒng)的壓力、流量影響小。有進樣閥和自動進樣裝置兩種。除使用自動進樣裝置外，用手工進樣均使用六通進樣閥。在工作狀態(tài)下，儀器系統(tǒng)內(nèi)處于高壓的狀態(tài)，借助于六通進樣閥，實現(xiàn)了常壓下不停流進樣。

　　六通進樣閥可分為定子和轉(zhuǎn)子兩部分，共有6個口，故稱為六通進樣閥。轉(zhuǎn)子通過扳手調(diào)節(jié)，可以分別處于“裝樣”和“進樣”兩個位置。當將扳手扳至“進樣”位時，進樣閥的流路發(fā)生了改變，流動相通過樣品管，將注入的樣品帶入色譜柱進行分析。六通進樣閥具有使用方便，進樣量準確等優(yōu)點。樣品環(huán)有10μl、20μl、50μl等不同容積，可以選配。樣品環(huán)不僅可以用來貯液，也可用來測量樣品溶液的體積。將樣品環(huán)裝滿后，進樣，進樣量即為樣品環(huán)的容積，此種進樣方式稱為“滿環(huán)進樣”或“定量環(huán)進樣”。用定量環(huán)進樣精密度好，在使用外標法時，應使用此種操作方式。

　　(三)色譜柱色譜柱是色譜分離的核心。為了保證色譜柱的柱效高，使用壽命長，一般使用由專業(yè)化工廠生產(chǎn)的商品柱。色譜柱管多由不銹鋼制成，內(nèi)裝一定的固定相。色譜往長一般10～30cm，內(nèi)徑2～5mm。

　　化學鍵合相是廣泛使用的固定相，其中又以十八烷基硅烷鍵合硅膠(octadecylsilylsilicagel，ODS)的應用最為廣泛，ODS為非極性化學健合相，此外還有辛烷基硅烷鍵合硅膠等，非極性化學健合相用于反相色譜法。中等極性的化學鍵合相有苯基化學鍵合相等，氰基化學鍵合相和氨基化學鍵合相是常用的極性化學鍵合相，極性的化學鍵合相一般用于正相色譜法。吸附色譜的固定相中使用最多的是硅膠。無論自己填裝的色譜柱還是購買的商品柱，使用能指標包括在一定實驗條件下的柱壓、理論塔板高度和理論塔板數(shù)、對稱因子、容量因子和選擇性因子的重復性等。

　　(四)檢測器樣品經(jīng)色譜柱分離后進入檢側(cè)器進行檢測。按其適用范圍檢測器可分為通用型和專屬型兩大類，專屬型檢測器只能檢測某些組分的某一性質(zhì)，紫外檢測器(UVD)，熒光檢測器(ED)屬于這一類，它們只對有紫外吸收或熒光發(fā)射的組分有響應;通用型檢測器檢測的是一般物質(zhì)均具有的性質(zhì)，示差折光檢測器(RID)，蒸發(fā)光散射檢測器(ELSD)等。